MILE米乐细胞培养指南

培养条件

气相条件为95%空气和5%二氧化碳，最佳培养温度为37℃。

传代方法

初次传代建议采用1:2的比例。传代后，建议每隔两天更换培养液。为确保细胞状态良好，建议在购买细胞时选择配套的培养基，以享受更优惠的价格。

细胞处理步骤

收到细胞后，请立即进行处理。将细胞培养到良好状态后，灌满完全培养液并封好瓶口，以保证运输安全。使用75%酒精对整个细胞瓶进行喷洒消毒后，放入超净台进行无菌操作，然后将细胞瓶放置于37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态。使用显微镜观察细胞生长情况，并拍照留存不同倍数的细胞图像（建议40x、100x、200x各一张），前三天的照片是重要的售后依据，若未提供照片，默认为细胞状态良好。

细胞培养步骤

传代处理：如果细胞汇合度未超过80%，请将瓶中的完全培养液收集至离心管中，保留5ml培养基，并继续放入37℃、5% CO2培养箱中。如果细胞密度超过80%，即可进行传代。

贴壁细胞的传代步骤：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁的PBS清洗细胞1-2次。
2. 加入约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，放入37℃培养箱中消化1-2分钟。观察细胞脱落情况，若大部分细胞变圆且脱落，迅速轻敲培养瓶，加入超过5ml的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞以确保其完全脱落后吸出细胞悬液，转移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，加入1-2ml完全培养基重悬细胞。
4. 按1:2的比例将细胞悬液分瓶（例如分至两个T25瓶），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

悬浮细胞的传代步骤：

1. 使用半换液法，竖着放置培养瓶于培养箱中静置1小时，轻轻吸去约3ml的培养基，然后补充3ml的完全培养基。如果培养基颜色变化缓慢，可以添加约500µl的FBS。传代时可直接添加5ml培养基并分至两个培养瓶，通常经过三次传代后可进行离心以去除死细胞。
2. 离心换液法：将细胞悬液收集至离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清，加入1-2ml培养液后重悬，然后按1:2的比例分至新的T25瓶中，添加6-8ml新配制的完全培养基，以确保细胞活力，后续传代根据实际情况按1:2至1:5的比例进行。

细胞冻存步骤

1. 当细胞生长覆盖培养瓶的80%时，弃去T25培养瓶内的培养液，并使用PBS清洗一次。
2. 加入约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，倒置观察细胞状态，待细胞回缩变圆后，加入5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使其脱落后，将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1mlMILE米乐的无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中。
4. 将冻存细胞放入-80℃冰箱储存。若后期需转移至液氮罐，则需在-80℃储存至少24小时后再转入液氮罐中。

细胞复苏步骤

1. 从液氮中取出冻存管（请佩戴防护面具），快速放入37℃水浴中解冻，直至冻存管内无结晶，然后用75%酒精擦拭管外壁。
2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，加入5ml完全培养基重悬细胞，并将其接种至T25培养瓶中，在37℃、5% CO2的培养箱内培养。
4. 第二天，使用新鲜的完全培养基继续培养。

注意事项

某些细胞可能在运输过程中不易贴壁，出现细胞脱落属于正常现象。如脱落情况较严重，可将培养瓶内的所有培养液收集至离心管，1000rpm离心5分钟，收集上清进行过渡培养（后续对比培养）。沉淀部分加入1-2ml胰酶并轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基以终止反应。再离心后弃去上清，加入1-2ml完全培养基重悬，然后按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2培养箱中培养。

通过专业的细胞培养操作，MILE米乐期待为您的科研工作提供高质量的细胞服务。